Вивчення біфідогенної дії сиропу Лактусан

Мета Дослідження

1. В експериментах in vitro вивчити вплив препарату Лактусан на зростання біфідобактерій (виробничий штам Bifidum I).

2. На моделі ампіцилін- та тетрациклін-індукованого дисбактеріозу у мишей вивчити вплив Лактусану на:

- Вміст біфідо-і лактобактерій;

- морфологію слизової оболонки товстої кишки;

- Морфологічний стан печінки.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

У роботі використано:

1. сироп Лактусан, що містить 40% лактулози, 16% інших вуглеводів (12% лактози та 4% галактози) та 1% золи;

2. біфідобактерії виробничого штаму Bifidobacterium bifidum l (препарат біфідум-бактерин виробництва ТОВ «Фермент»);

3. антибіотики - ампіцилін натрієва сіль, тетрациклін;

4. миші лінії Fl (CBA/lac x BL/6) масою тіла 20 г;

5. біологічний матеріал (печінка, кишечник, фекалії, кров) від мишей.

При бактеріологічному дослідженні in vitro Лактусан застосовували у вигляді 2,5%-0,000025%-ному розчинів (концентрації лактулози 10-0,1 мкг/мл відповідно) у напіврідкому середовищі Блаурокка або ізотонічному 0,9%-ному розчині хлориду натрію. Біфідумбактерин розчиняли в рідкому середовищі Блаурокка з розрахунку 1 мл на 1 дозу препарату і додавали по 0,5 мл отриманої мікробної суспензії в ряд пробірок, що містять Лактусан у зазначених концентраціях у тому ж середовищі. У контрольні зразки вносили аналогічну кількість біфідобактерій серед Блаурокка без Лактусана. Контрольні та дослідні зразки інкубували в анаеростаті протягом 48-72 годин при температурі 37°С, після чого проводили раститровку культури, що виросла в напіврідкому середовищі Блаурокка загальноприйнятим методом.

Вибірково з різних розведень біфідобактерій перед посівом робили контрольні мазки на склі та мікроскопували їх при фарбуванні метиленовим синім. Після інкубації було проведено перегляд мазків з 50 посівів, у яких візуально зареєстровано зростання культури.

Експерименти in vitro з вивчення впливу Лактусану на мікрофлору та слизову оболонку кишечника, а також стан печінки проведені на 100 мишах Fl (СВА/С57ВL6) масою тіла 18-20 г.

Модель медикаментозної патології відтворювали шляхом інтрагастрального введення ампіциліну в дозах 350-700 мг/кг або тетрацикліну в дозі 750 мг/кг щодня протягом 7 днів.

Лактусан вводили інтрагастрально, у вигляді 20-0,15% розчину 0,25 мл фізіологічного 0,9%-ного розчину хлориду натрію, при цьому дози лактулози становили відповідно 1000-7,5 мг/кг.

Курс одночасного застосування Лактусану з антибіотиком складав 7 днів. В окремій серії експериментів Лактусан вводили протягом 14 днів (7 днів на тлі тетрацикліну та протягом наступних 7 днів).

Матеріал для дослідження брали через 24 години після останнього введення випробуваного препарату, відразу після вибою тварин декапітацією.

Відрізки проксимальних відділів товстої кишки та шматочки печінки, взяті від тварин, фіксували у 10% нейтральному розчині формаліну та заливали у парафін.

Гістологічні дослідження проводили на зрізах товщиною 5 мкм, пофарбованих гематоксилін-еозином, альціановим синім, гематоксиліном Ерліха та еозином, а також пірофуксином за Ван-Гізоном.

Активність лізоциму у сироватці крові визначали мікробіологічним чашковим методом (Каграманова К. А., Єрмольєва З.Б. 1964).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Вивчення впливу Лактусану на біфідо- та лактобактерії in vitro

Розчини Лактусану з концентраціями лактулози в 100-10 мкг/мл мали виражену біфідогенну дію, збільшуючи вміст біфідобактерій на 5-6 lg порівняно з контролем. При використанні розчинів Лактусану з концентраціями лактулози 1-0,1 мкг/мл спостерігали зростання кількості біфідобактерій на 3-4 lg. Присутність лактулози в концентраціях 10 мг/мл і вище серед культивування біфідобактерій призводило до вираженого газоутворення.

Таким чином, біфідогенна дія лактулози в сиропі Лактусан є максимально вираженою при її концентраціях 100-10 мкг/мл.

Вивчення впливу Лактусану на макроорганізм та його мікрофлору

Для вивчення ефектів Лактусану in vitro нами використано дві експериментальні моделі лікарської патології, спричиненої пероральним застосуванням великих доз ампіциліну та тетрацикліну. Це зумовлено тим, що обидва антибіотики у високих концентраціях виявляються в жовчі, тетрациклін у значних кількостях (20-50%) виділяється з калом. У зв'язку з цим, до основних проявів побічної дії цих антибіотиків на організм відносяться дисфункції травного тракту та дисбактеріоз, а тетрациклін при його застосуванні у високих дозах може мати гепатотоксичний ефект.

А. Біфідогенні ефекти Лактусану in vivo

У модельних експериментах на тваринах, яким вводили антибіотики, було чітко простежено залежність біфідогенного ефекту Лактусана від його дози.

Ампіцилін-індукований дисбіоз.

Ампіцилін у дозі 350 мг/кг після 7-денного перорального застосування суттєво не впливав на вміст біфідобактерій у травному тракті мишей, що залишався на рівні інтактного контролю (10 9  КУО/г). Не було виявлено пригнічення кишкової біфідофлори також після введення ампіциліну протягом ще 4 днів на фоні голодування. При одночасному застосуванні з ампіциліном лактулоза у складі Лактусану мала виражений біфідогенний ефект у дуже широкому діапазоні доз – від 7,5 до 1000 мг/кг. Оптимальне підвищення вмісту біфідобактерій (до 10 13  KOE/г, тобто на 4-6 lg вище, ніж у інтактних тварин) було досягнуто при застосуванні лактулоз у дозах від 7,5 до 125 мг/кг.

Лактулоза в дозах 250-1000 мг/кг забезпечувала менш виражену стимуляцію зростання біфідобактерій, але їхній рівень залишався на 2-3 lg вище контрольного. Однак у мишей, які отримували 1000 мг/кг лактулози, відмічено появу рідкого випорожнення.

Ампіцилін викликав пригнічення зростання лактобактерій, про що свідчить зниження їх вмісту на 2 порядки (до 10 4-5  КУО/г при 10 6-7  КУО/г у інтактних тварин).

Стимуляція Лактусаном зростання лактобактерій на цій експериментальній моделі виявлялася за всіх випробуваних доз. Його застосування у всіх випадках запобігало індукованому ампіциліном зниження рівня лактобактерій, а при дозах лактулози 7,5-125 мг/кг їх вміст на 3-4 lg перевищував рівень у мишей, які отримували тільки антибіотик, і було на 2 lg вище, ніж у контролі.

Тетрациклін-індукований дисбіоз.

Тетрациклін у дозі 750 мг/кг після 7-денного курсу його застосування спричинив зниження вмісту біфідобактерій у фекаліях мишей на 2 lg порівняно з інтактним контролем.

Введення одночасно з тетрацикліном лактулози в дозах 125-62,5 мг/кг не тільки запобігало пригніченню біфідобактерій, але й забезпечувало підвищення рівня на 2-3 lg. Важливо відзначити, що на цій експериментальній моделі оптимальний біфідогенний ефект (зростання рівня біфідобактерій на 4 lg порівняно з контролем) відзначався у групі тварин, які отримували лактулозу у дозі 125 мг/кг протягом 14 днів (7 днів на фоні тетрацикліну та 7 днів після його відміни). Ця схема застосування Лактусану забезпечувала також підвищення рівня лактобактерій не менше ніж на 2 lg порівняно з інтактним контролем. У мишей цієї групи зазначено також помірне зростання вмісту лізоциму в сироватці крові мишей - до 4 мкг/мл при 2,0-2,6 мкг/мл у контролі та у мишей, які отримували лише тетрациклін.

Застосування і натомість тетрацикліна 1,25%-ного розчину Лактусана, тобто. лактулози в дозі 62,5 мг/кг, забезпечувало збереження вихідного рівня лактобактерій у фекаліях мишей.

B. Морфологічні дослідження.

1. Дослідження слизової оболонки кишківника

Ампіцилінова модель

Ампіцилін у дозі 350 мг/кг інтрагастрально протягом 7 днів індукував розвиток у тонкій кишці морфологічної картини помірного токсичного ентериту, який характеризувався дистрофією поверхневого епітелію кишкових ворсинок по всій їх довжині, лімфостазом та набряком. У товстій кишці відмічені явища мінімального токсичного коліту: дистрофія поверхневих епітеліоцитів, повнокровність судин субепітеліальних відділів строми та її набряк.

Застосування Лактусану в оптимальній дозі лактулози 125 мг/кг одночасно з ампіциліном ефективно захищало слизову оболонку кишечника, забезпечуючи повну нормалізацію її морфології та клітинного складу.

Тетрациклінова модель

Під впливом тетрацикліну у слизовій оболонці тонкого кишечника спостерігали морфологічні ознаки токсичного ентериту; виражену вакуольну дистрофію епітеліоцитів ворсинок; велика кількість міжепітеліальних лімфоцитів (МЕЛ) у поверхневому епітелії слизової оболонки кишки; в епітелії ворсинок виявлялося мало келихоподібних клітин і вони слабо забарвлювалися альціановим синім, що свідчить про їхню слабку функціональну активність.

Важливо відзначити виявлену під впливом антибіотика дегрануляцію клітин Панета, які є основними продуцентами ендогенного лізоциму та секреторних імуноглобулінів у кишечнику ссавців.

У товстій кишці мишей, які отримували тетрациклін, розвивалася типова морфологічна картина токсичного коліту. В однієї миші гістологічно було виявлено криптальний абсцес, у всіх тварин спостерігалися дистрофічні зміни епітеліоцитів, у поверхневому епітелії зростала чисельність міжепітеліальних лімфоцитів та бокалоподібних клітин, слабо забарвлених альціановим синім.

Лактусан при його застосуванні протягом 14 днів (7 днів на фоні антибіотика та 7 днів після його відміни) по 0,25 мл 2,5% розчину, що відповідає дозі лактулози 125 мг/кг, ефективно перешкоджав розвитку зазначених змін та забезпечував повну нормалізацію морфології слизової оболонки тонкої та толстої.

2. Дослідження стану печінки

Виявлено захисну дію лактулози у складі Лактусану на тканину печінки, яка найбільш яскраво виявлялася при тетрациклін-індукованому лікарському ураженні.

Тетрациклінова модель

Під впливом тетрацикліну ми спостерігали типові прояви гострого токсичного медикаментозного гепатиту з вираженим фіброзом більшості портальних трактів. У часточках печінки відзначалося пошкодження переважно центролобулярних та перипортальних гепатоцитів.

Оптимальний захист тканини печінки від ушкоджуючої дії тетрацикліну забезпечила лактулозу в дозі 125 мг/кг, яку вводили протягом 7 днів на фоні антибіотика та 7 днів після його відміни. У тварин цієї групи морфологічна картина печінкової тканини не відрізнялася від такої інтактних тварин.

При застосуванні лактулози у дозі 62,5 мг/кг протягом 7 днів на тлі тетрацикліну не виявлялося типових для дії антибіотика явищ гострого токсичного гепатиту. Виявлено жировий гепатоз різної виразності з помірним фіброзом більшості портальних трактів.

Таким чином, на вибраній нами моделі тетрациклін-індукованого токсичного гепатиту значна протективна дія Лактусану на тканину печінки проявляється лише в дозі лактулози, що відповідає 125 мг/кг.

Ампіцилінова модель

На відміну від тетрацикліну, ампіцилін не викликав значних ушкоджень тканини та клітинного складу печінки мишей. Її гістологічна структура у мишей, які отримували ампіцилін, мало відрізнялися від такої в інтактних тварин. Зазначено лише наявність помірного фіброзу окремих портальних трактів.

У більшості тварин, які отримували на тлі ампіциліну лактулозу в дозах від 31,25 до 125 мг/кг, морфологічна картина тканини печінки була близька до такої в контролі. Спостерігалося деяке збільшення просвіту центральних вен та печінкових вен портальних трактів. У ряді випадків на тлі легкого чи помірного фіброзу окремих портальних трактів виявлено явища мінімального жирового гепатозу. При використанні 5% розчину Лактусану (доза лактулози 250 мг/кг) явища фіброзу були більш виражені.

Найкращу захисну дію лактулоза у складі Лактусана надавала дозі 125 мг/кг, тобто. 300 мг/кг Лактусану.

ВИСНОВКИ

1. 1. Концентрат лактулози Лактусан має виражену біфідогенну дію, стимулюючи зростання біфідобактерій in vitro та in vivo.
2. 2. Біфідогенний ефект Лактусану проявляється у широкому діапазоні доз. Оптимальний біфідогенний ефект in vitro надають 0,025% та 0,0025% розчини Лактусану, що відповідає концентраціям лактулози 100 та 10 мкг мл. Виражена стимуляція біфідо- та лактофлори у мишей на моделі дисбіозу, індукованого ампіциліном або тетрацикліном, проявляється при застосуванні Лак тусану по 0,25 мл 2,5-0,15% розчинів, що відповідає дозам лактулози 125-7,5 мг/кг.
3. 3. Лактусан має дозозалежний протективний ефект на тканину печінки та слизову оболонку кишечника, запобігаючи побічній токсичній дії високих доз тетрацикліну та ампіциліну. Лактусан у вигляді 2,5%-ного розчину (доза лактулози 125 мг/кг) виявляв виражену захисну дію на тканину печінки, слизову оболонку тонкої та товстої кишки при його одночасному застосуванні з високими дозами ампіциліну та тетрацикліну.
4. 4. Максимальний ефект Лактусану отримано при введенні лактулози у дозі 125 мг/кг протягом 14 днів (7 днів на фоні тетрацикліну та 7 днів після відміни антибіотика). Застосування Лактусана за цією схемою забезпечувало найбільше зростання вмісту біфідо-і лактобактерій, повністю запобігало розвитку індукованих тетрацикліном токсичних уражень печінки та слизової оболонки кишечника.
5. 5. Виявлено перспективність та доцільність продовження експериментального вивчення властивостей Лактусану та механізмів їх реалізації, пошуку шляхів посилення його пробіотичних та гепатопротективних ефектів з метою розробки оптимальних умов його використання в медичній практиці для профілактики та лікування алкогольних, медикаментозних та інших уражень травного тракту.